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转染细胞的挑选注意事项

作者:标准菌株生产厂家 来源:www.njlezhen.com 发布于:2018-6-22 11:21:29 点击量:

   在挑选转染细胞时要注意一些事项,比如要明确抗生素的合适浓度、要选择好抗生素的种类等,那么,为什么要注意这些事项呢?那是因为每一个细胞株对抗生素的敏感程度是不同的.如果你想确定抗生素的最佳浓度,就必须要在一天之内种好多个细胞,甚至还要进行过夜培育.

 
 
  将培养液换成含抗生素的培养基,抗生素浓度按梯度递增0,50,100,200,400,600,800和1000μg/ml.培养10-14天以绝大部分细胞死亡浓度为准,一般为400-800μg/ml,筛选稳定表达克隆时可比该浓度适当提高一个级别维持时使用筛选浓度的一半.
 
  转染按前面的步骤进行.转染72小时后按1:10的比例将转染细胞在6孔板中传代,换为含预试验中确定的抗生素浓度的选择培养基.在6孔板内可见单个细胞,继续培养可见单个细胞分裂繁殖形成单个抗性集落,此时可用两种方法挑选单克隆.
 
 
  滤纸片法:用消毒的5x5mm滤纸片浸过胰酶,将滤纸片贴在单细胞集落上10-15秒,取出粘附有细胞的滤纸片放于24孔板中继续加压培养.细胞在24孔板中长满后转入25cm2培养瓶中,长满后再转入75cm2培养瓶中培养.有限稀释法:将细胞消化下来后做连续的10倍稀释,将每一稀释度的细胞滴加到96孔板中培养,7-10天后,选择单个克隆生长的孔再一次进行克隆.
 
 
  ELISA或Westernblot检测单克隆细胞中外源蛋白的表达情况由于不同克隆的表达水平存在差异因此可同时挑选多个克隆选择表达量最高的克隆传代并保种.



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