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怎么贮藏微生物菌种【8中方法】

作者:标准菌株生产厂家 来源:www.njlezhen.com 发布于:2018-10-10 11:24:42 点击量:

   1、传代保存法:有些微生物当遇到冷冻或干燥等处理时,会很快死亡,因此在这种情况下,只能求助于传代培养保存法.传代培养就是要定期地进行菌种转接、

  培养后再保存,它是最基本的微生物保存法,例如酸奶等常用生产菌种的保存.传代保存时,培养基的浓度不宜过高,营养成分不宜过于丰富,尤其是碳水化合物的浓度应在可能的范围内尽量降低.培养温度通常以稍低于最适生长温度为好.若为产酸菌种,则应在培养基中添加少量碳酸钙.
 
  一般地,大多数菌种的保藏温度以5℃为好,像厌氧菌、霍乱弧菌及部分病原真菌等微生物菌种则可以使用37℃进行保存,而蕈类等大型食用菌的菌种则可以室温直接保存.
 
  传代培养保存法虽然简便,但其缺点也很明显,如:①菌种管棉塞经常容易发霉;②菌株的遗传性状容易发生变异;③反复传代时,菌株的病原性、形成生理活性物质的能力以及形成孢子的能力等均有降低;④需要定期转种,工作量大;⑤杂菌的污染机会较多.
 
 
 
  2、液体石蜡覆盖保存法:该法较前一种方法保存菌种的时间更长,适用于霉菌、酵母菌、放线菌及需氧细菌等的保存.此法可防止干燥,并通过限制氧的供给而达到削弱微生物代谢作用的目的.其具有方法简便的优点,同时也适用于不宜冷冻干燥的微生物(如产孢能力低的丝状菌)的保存,而某些细菌如固氮菌、乳酸杆菌、明串珠菌、分枝杆菌、红螺菌及沙门氏菌等和一些真菌如卷霉菌、小克银汉霉、毛霉、根霉等不宜采用此法进行保存.
 
 
  3、载体保存法:即将微生物吸附在适当载体上进行干燥保存的方法.常用的有方法包括以下几种,如
 
  ①土壤保存法:主要用于能形成孢子或孢囊的微生物菌种的保藏.方法是在灭菌的土壤中加入菌液,立即在室温下进行干燥或使菌体繁殖后再干燥,然后冷藏或在室温下密封保存.保存用的土壤原则上以肥沃的耕土为宜,土壤需风干、粉碎、过筛和灭菌.使微生物在土壤中繁殖后进行干燥保存的方法是:取适量土壤(5克)置于塞有棉塞的试管中,加水或加入充分稀释的液体培养基(以含水量为土壤最大持水量的60%为宜),然后高压灭菌.再将需保存的微生物进行大量接种,培养至菌丝能用肉眼确认的程度为止,移入干燥器中经短时间干燥或风干后密封,冷藏或室温保存.
 
  ②砂土保存法:取清洁的砂,筛去掉大砂粒,并用磁铁吸去砂中铁屑,再用NaOH溶液、10%HCl溶液和水交替清洗数次,干燥后,置于试管或安瓶管中保持2~3cm深,再经干热灭菌后,加入1ml菌种培养液,经充分混匀后,放入真空干燥器中,完全干燥后熔封保存.也可用二份洗净的砂(经HCl预处理)和一份贫瘠、过筛的黄土搀和后灭菌,再进行菌种保藏.
 
  ③硅胶保存法:以6~16目的无色硅胶代替砂子,干热灭菌后,加入菌液.加菌液时,由于硅胶的吸附热常使温度升高,因而需设法加以冷却.
 
  ④磁珠保存法:将菌液浸入素烧磁珠(或多孔玻璃珠)后再进行干燥保存的一种方法.在螺旋口试管中装入1/2管高的硅胶(或无水CaSO4),上铺玻璃
 
  棉,再放上10~20粒磁珠,经干热灭菌后,接入菌悬液,最后冷藏、室温保藏或减压干燥后密封保藏.本法对酵母菌很有效,特别适用于根瘤菌,可保存长达两年半时间.
 
  ⑤麸皮保存法:在麸皮内加入60%的水,经灭菌后接种培养,最后干燥保藏.
 
  ⑥纸片(滤纸)保存法:将灭菌纸片浸入培养液或菌悬液中,常压或减压干燥后,置于装有干燥剂的容器内进行保存.
 
  4、悬液保存法:即使微生物混悬于适当溶液中进行保存的方法.常用的有,
 
  ①蒸馏水保存法:适用于霉菌、酵母菌及绝大部分放线菌,将其菌体悬浮于蒸馏水中即可在室温下保存数年.本法应注意避免水分的蒸发.  ②糖液保存法:适用于酵母菌,如将其菌体悬浮于10%的蔗糖溶液中,然后于冷暗处保存,可长达10年.除此之外,也可使用缓冲液或食盐水等进行保存.
 
 
  5、寄主保存法:即令微生物侵入其寄主后加以保存的方法.
 
  6、冷冻保存法:适用于抗冻力强的微生物.这些微生物可在其菌体细胞外遭受冻结的情况下而不受损伤,而对其它大多数微生物而言,无论在细胞外冻结还是在细胞内冻结,都会对菌体造成损伤,因此当采用这种保藏方法时,应注意以下几点,  ①要选择适于冷冻干燥的菌龄细胞;
 
  ②要选择适宜的培养基,因为某些微生物对冷冻的抵抗力,常随培养基成分的变化而显示出巨大差异;
 
  ③要选择合适的菌液浓度,通常菌液浓度越高,生存率越高,保存期也越长;
 
  ④最好在菌液内不添加电解质(如食盐等);
 
  ⑤可在菌液内添加甘油等保护剂,以防止在冷冻过程中出现菌体大量死亡的现象.同样,也可添加各种糖类、去纤维血液和脱脂牛乳等具有良好保护效果的溶剂,但对有些微生物而言,不加保护剂时更有效.
 
  ⑥原则上应尽快进行冷冻处理,但当加入保护剂时,可静置一段时间后再进行处理.
 
  ⑦就动物细胞而言,应在-20℃范围内以1℃/min左右的速度缓慢降温,此后必须尽快降到贮藏温度;而对绝大多数微生物而言,则不必如此,如结构较为复杂的原虫则可在-35℃范围内进行缓慢降温,而噬菌体则必需采用上述的二阶段法进行冷冻;
 
  ⑧若进行长期保存,则贮藏温度越低越好;
 
  ⑨取用冷冻保存的菌种时,应采取速融措施,即在35~40℃温水中轻轻振荡使之迅速融解.而就厌氧菌来说,则应选择静置融化的措施.当冷冻菌融化后,应尽量避免再次冷冻,否则菌体的存活率将显著下降.
 
  常用的冷冻保存法包括:
 
  ①低温冰箱保存法(-20℃、-50℃或-85℃):低温冷冻保存时使用螺旋口试管较为方便,也可在棉塞试管外包裹塑料薄膜.保存时菌液加量不宜过多,
 
  有些可添加保护剂.此外,也可用φ5mm的玻璃珠来吸附菌液,然后把玻璃珠置于塑料容器内,再放入低温冰箱内进行保存的.
 
  ②干冰保存法(-70℃左右):即将菌种管插入干冰内,再置于冰箱内进行冷冻保存.
 
  ③液氮保存法(-196℃):是适用范围最广的微生物保存法.其操作步骤如下,
 
  a、装安瓶管:使用尽量浓厚的菌体悬浮于含有适当防冻剂(保存霉菌不用防冻剂)的灭菌溶液中,将0.2~1ml的这种溶液分装于安瓶中,或在装有分散剂的安瓶中直接接种,或将菌丝体琼脂块直接悬浮于分散剂中.
 
  b、熔封安瓶管:若直接贮存于气相液氮中(-150℃~-170℃)时,则不需熔封.
 
  c、检查安瓶管是否熔封良好:即在4℃下,将熔封安瓶管在适当的色素溶液中浸泡2~30分钟后,观察有无色素进入安瓶.
 
  d、缓慢冷却:将熔封安瓶管置于小罐中,然后用液氮气以约1℃/min的速度冷却至-25℃左右,也可在-20℃~-25℃的冰箱内缓慢冷却30~60min.
 
  e、速冷:最后浸入液氮中快速冷却至-196℃.
 
  7、冷冻干燥保存法:其原理是首先将微生物冷冻,然后在减压下利用升华现象除去水分.事实上,从菌体中除去大部分水分后,细胞的生理活动就会停止,因此
 
  可以达到长期维持生命状态的目的.该方法适用于绝大多数微生物菌种(包括噬菌体和立克次氏体等)的保存.在进行冷冻干燥时,需注意以下几个问题:
 
  a、冷冻干燥前的培养条件:首先检验菌种纯度.一般地说,将待保存的微生物在营养丰富且容易增菌的培养基上进行培养为宜;菌龄以达到对数生长期为好;若为有芽孢或孢子的微生物,则以芽孢和孢子形成以后进行保存为好;菌液浓度以高为好,如细菌应达到109~1010/ml.
 
  b、菌株号码等的标记:可在安瓶外侧标记或在安瓶内封入标签.
 
  c、安瓶的准备:将安瓶在2%HCl中浸泡过夜,自来水冲洗3次后,蒸馏水刷净,干燥,塞棉塞,贴标签,干热灭菌或温热灭菌后,60℃恒温干燥.
 
  d、添加保护剂:常用的保护剂有脱脂乳、12%蔗糖、加7.5%葡萄糖的普通肉汤以及加7.5%葡萄糖的血清等等.
 
 
  8、甘油管保藏法:在5ml菌种保藏管中,将等体积的菌悬液和40%的甘油充分混匀后,于-20℃冰箱中保存.
 
  以上内容来自于百度经验



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